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    實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

  • 發(fā)布日期:2017-12-25      瀏覽次數(shù):2853
    • 實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

      親和層析法純化的二抗

      用親和層析法純化的抗體是指,利用耦聯(lián)到瓊脂糖凝膠上的抗原將抗血清中的抗體親和層析下來。我們采用一種*的連續(xù)的洗脫過程將抗體從固態(tài)抗原上分離出來。我們提供的未標(biāo)記的親和層析法純化的抗體是不含有穩(wěn)定劑和防腐劑的無菌液體。耦聯(lián)標(biāo)記物的抗體是凍干粉,里面含有穩(wěn)定劑和防腐劑,但是過氧化物酶標(biāo)記的抗體里面不含防腐劑。  

      親和層析純化抗體的選擇和定位

      *步: 選擇 Whole IgG  F(ab ’)2 片段,或者 Fab 片段抗體。 
      我們提供三種親和純化的二抗: Whole IgG , F(ab ’)2 片段, Fab 片段。  

      Whole IgG 抗體是從抗血清中分離出來的完整的分子。這些抗體有一個 Fc 部分和兩個與抗原結(jié)合的 Fab 部分,因此是二價的(圖 1 )。它的平均分子量約為 160KD , Whole IgG 抗體適用于多數(shù)情況,也是的。

      F(ab ’)2 片段   抗體是用胃蛋白酶消化 IgG 去除 Fc 部分,剩下兩個靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的 Fab 部分,依然是二價的。(圖 1 )這抗體用在特定的情況中,例如避免抗體與 Protain A  G 結(jié)合,或者與有 Fc 受體的活細(xì)胞結(jié)合。但是,如果一抗是 whole IgG ,不管二抗是哪種形式都可能出現(xiàn)結(jié)合 Fc 受體。這時,為了阻止抗體結(jié)合到 Fc 受體上,可以在 4 度將細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)于含有疊氮鈉和二抗來源物種正常血清的緩沖液中。

      注意:當(dāng)使用的是帶標(biāo)記的二抗時,千萬不能用一抗來源物種的正常血清和 IgG 來封閉。如果血清中的免疫球蛋白非特異性的結(jié)合到樣品上,他們會被帶有標(biāo)記的二抗識別,導(dǎo)致背景過高。

      牛血清白蛋白( BSA )和奶粉是zui為常用的封閉液,它們可能含有 IgG, 除了??寡?/span> IgG 外,許多二抗如抗牛,抗山羊,抗綿羊與牛 IgG 有較強(qiáng)的反應(yīng)。因此,使用 BSA 或奶粉封閉或稀釋抗體會增加背景或降低抗體效價。推薦用來自二抗的物種的正常血清( 5% v/v )封閉。

       Fab 片段   抗體是用木瓜蛋白酶消化 IgG 后得到的。這些抗體只含有一個結(jié)合位點(圖 1 )。它們用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白,或者在使用相同物種來源的一抗作多標(biāo)記的實驗中,用于封閉暴露的免疫球蛋白。而二價的抗體( whole IgG  F  ab’  2 片段)不能用來封閉,因為它們有二個結(jié)合位點。封閉后,一些結(jié)合位點可能為暴露出來,與一抗結(jié)合,從而導(dǎo)致高的背景或假陽性標(biāo)記。

      第二步: 在左邊標(biāo)記“ antibody description ”的攔里找到一抗的物種來源。

      抗體是根據(jù)一抗的物種來源的字母表順序排列。比如,如果一抗是小鼠來源的,就找“ anti-mouse ”。

      說明:目錄中提供了抗敘利亞倉鼠和抗亞美尼亞倉鼠的抗體。為了正確的選擇二抗,必須知道一抗是在哪種倉鼠中制備的。

      第三步: 在標(biāo)有“ Host ”這一欄中選擇二抗的物種來源。

      二抗的物種來源在抗體描述的開始部分,選擇二抗的物種來源應(yīng)考慮幾點: 1) 個人的取向或經(jīng)驗。 二抗的質(zhì)量問題與物種特異性沒有關(guān)系。2 )與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合。兔抗體能很好地與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合,但羊和猴抗體能更好的與蛋白G結(jié)合。 3 )經(jīng)物種吸附處理的抗體可用性。某些物種來源的抗體可能不能被具有交叉反應(yīng)的物種進(jìn)行吸附處理。選擇經(jīng)過吸附處理的物種。4 )物種兼容性。 在多標(biāo)記實驗中,一些物種不能和其他物種兼容。一般地,多標(biāo)記二抗必須來自同一物種。

      第四步: 在“ antibody description  下面選擇二抗的特異性。

      下面詞語的解釋將對選擇合適的抗體有所幫助。

      注意:不同來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu),抗體的生成過程也相似??挂粋€物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng), 除非特異性的經(jīng)過交叉反應(yīng)物種的吸附處理。在抗體描述中,經(jīng)過其他物種的吸附處理的抗體標(biāo)有“ (min X …Sr Prot) ”字樣 。

      Anti-IgG (H+L)

      這類抗體和 IgG 分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng),比如,和 IgG 分子的 Fc , F(ab ’)2/Fab 部分。 Anti-IgG (H+L) 抗體也可以和其他的免疫球蛋白家族( IgM  IgA ,IgD,IgE )和亞家族反應(yīng),因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈(或者 κ 鏈,或者 λ 鏈)。 Anti-IgG (H+L) 抗體比只抗片段的抗體識別更多的抗原表位,適合普通的免疫檢查過程。

      Anti-IgG , Fc/ Fc γ fragment specific

      這類抗體和 IgG 重鏈的 Fc 部分反應(yīng)。它們通過 ELISA 檢測,和 / 或針對 Fab 片段吸附測試。某些情況下,這類抗體需要額外檢測和 / 或吸收處理來降低 IgM   IgA 的交叉反應(yīng)。在這種情況下( 抗人,抗鼠和抗大鼠 ),抗體標(biāo)有“抗IgG  Fc γ )”,表示這類抗體只與 IgG 重鏈反應(yīng),通常不能和 IgA  IgM 任何表位反應(yīng)。

      注意:不是所有 anti-IgG, Fc 抗體和所有亞型的 IgG 反應(yīng)能力一致。要找和四種 IgG 亞類反應(yīng)能力差不多的 抗鼠IgG, Fc γ抗體的話,應(yīng)當(dāng)選羊抗鼠IgG( 亞類1+2a +2b+3), Fc γ特異性片段(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot) 。

      Anti-IgG , F(ab ’)2 fragment specific

      這類抗體和 IgG  F(ab ’)2/Fab 部分反應(yīng)。它們經(jīng)過了 ELISA  /  Fc 片段的吸附檢測。它們不是特異性 IgG ,因為它們是和輕鏈反應(yīng)的,它們同時也和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白( Ig D, IgM, IgA 和IgE )和亞類反應(yīng)。

      (min X …Sr Prot)

      與一個物種反應(yīng)的二抗可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng),除非這類抗體經(jīng)過其他物種的吸收實驗。這類抗體經(jīng)過了檢測,以及針對 IgG 和圓括號中的物種的血清蛋白的吸附處理。 (標(biāo)有“ (min X…Prot)” 字樣的抗體是經(jīng)過了圓括號中所標(biāo)的物種的 IgG  / 或血清蛋白的吸附處理的)。當(dāng)其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時,推薦使用這類抗體。但是,當(dāng)要選擇經(jīng)過針對相近物種吸附處理的抗體時,要特別注意,因為它們能識別的表位數(shù)量大大減小了,可能識別單抗的能力很弱。例如,在含有內(nèi)源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中,只用經(jīng)大鼠 IgG 吸附處理的抗鼠 IgG 檢測大鼠組織中的鼠源一抗,或者在多標(biāo)記實驗中使用了大鼠的一抗。另個一個例子是抗大鼠 IgG(min X Mouse… Sr Prot) 和抗敘利亞倉鼠 IgG  min X….Mouse, Rat Sr Prot )。

      實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

      以下是圓括號中所使用的一些簡稱:

      Bov = Bovine
            Ck = Chicken
            Gt = Goat
            GP = Guinea Pig
            Sy Hms = Syrian Hamster
            Hrs = Horse
            Hu = Human
            Ms = Mouse
            Rb = Rabbit
            Shp = Sheep
            Sw = Swine
            Sr = Serum
            Prot = Protein.

      ML  Multiple Labeling 

      有些抗體標(biāo)明了“ ML  ,來強(qiáng)調(diào)它們除了可以用于單標(biāo),還可用于多標(biāo)記實驗。

      抗亞美尼亞倉鼠IgG 和抗敘利亞倉鼠IgG

      大部分倉鼠單克隆抗體是來原于亞美尼亞倉鼠的脾臟細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞,它是亞美尼亞(而不是敘利亞)倉鼠IgG. 許多商業(yè)化的多克隆抗倉鼠IgG 是抗敘利亞倉鼠IgG, 這種抗體在檢測亞美尼亞倉鼠IgG 單克隆抗體時,它的效果沒有抗亞美尼亞倉鼠IgG 好。

      注意:抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X Bov, Hu, Ms , Rb, Rat Sr Prot) 不能識別所有的亞美尼亞倉鼠單克隆抗體,因為它經(jīng)相近物種的吸附處理過(粗體字)。因此,使用經(jīng)過少數(shù)物種或少數(shù)相近物種的吸附處理過的抗體可達(dá)到較好的效果,如抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X BoV Sr Prot), 除此之外,在小鼠或大鼠免疫球蛋白中也應(yīng)該檢測亞美尼亞倉鼠單抗。

      第五步: 從表格頂部選擇需要的探針。

      關(guān)于探針的技術(shù)信息參考其他網(wǎng)頁。

      第六步:  antibody description 一行和探針欄相交處,找到選擇的抗體的價錢、規(guī)格和目錄號。

      每個方格頂部的數(shù)字是每單位的價錢,底部的 9 位數(shù)字為目錄號。

      第七步: 以定購目的查看產(chǎn)品說明

      為了避免錯誤,產(chǎn)品說明應(yīng)該遵循一個特定的語法排列。比如,目錄號為 115  096  072 的產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)描述為:

      FITC-conjugated 
      |

      AffiniPure
      |

      F(ab)2 fragment 
      |

      of Goat
      |

      Anti-Mouse 
      |

      IgG, F(ab)2 fragment specific 
      |

      A

      B

      C

      D

      E

      F

       

       

      (minimal cross-reactivity to human, bovine, and horse serum proteins) 
      |

       

      G

       

       

       

       

       

       

       

       

      A.       耦聯(lián)的探針說明,如熒光素,酶,生物素等。如果抗體沒有耦聯(lián),不用寫。

      B .      抗體純化是商標(biāo)名字,是指從抗血清中通過偶聯(lián)瓊脂糖的抗原免疫層析的方法分離得到的抗體。

      C .抗體的形式- 完整IgG, 或者 F(ab ’)2 、 Fab 片段。

      D.      抗體來源物種名稱。

      E      和該抗體反應(yīng)的物種名稱。

      F.     抗體特異性描述。

      G.      經(jīng)過吸附處理以后減小了交叉反應(yīng)的物種名稱。  

      實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

       

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